Εισαγωγή στην αρχή και εφαρμογή των γενικών συστατικών του φασματοφωτομέτρου

Το φασματοφωτόμετρο χρησιμοποιείται ευρέως στη βιολογική, χημική, κλινική και περιβαλλοντική έρευνα.
Η φασματοφωτομετρία μετρά πόση φως ένα χημικό μπορεί να απορροφήσει περνώντας μια δέσμη φωτός μέσω ενός δείγματος σε ένα φασματοφωτόμετρο.
Μέσω της μέτρησης της έντασης του φωτός, η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της διαλελυμένης ουσίας στο δείγμα.
Η έννοια της φασματοφωτομετρίας
Η δέσμη που αποστέλλεται στο δείγμα αποτελείται από δέσμη φωτονίων.
Όταν τα φωτόνια συναντούν τα μόρια του δείγματος, τα μόρια μπορούν να απορροφήσουν μερικά από αυτά, να μειώσουν τον αριθμό των φωτονίων στη δέσμη και να μειώσουν την ένταση του σήματος ανίχνευσης.
Η μετάδοση είναι μέρος του φωτός που διέρχεται από το δείγμα. Ορίζεται ως ένταση φωτός που διέρχεται από το δείγμα στην ένταση του προσπίπτοντος φωτός.
Η απορρόφηση είναι αντίθετη προς τη μετάδοση, που αντιστοιχεί στην ποσότητα που μετράται από το φασματοφωτόμετρο.
Σύμφωνα με την απορρόφηση, η συγκέντρωση του δείγματος διαλύματος μπορεί να προσδιοριστεί από το νομοσχέδιο Lambert, που δείχνει ότι υπάρχει γραμμική σχέση μεταξύ της απορρόφησης και της συγκέντρωσης του δείγματος. Σύμφωνα με τον νόμο της μπίρας Lambert, η απορρόφηση είναι το προϊόν του συντελεστή απορρόφησης, το οποίο είναι ένα μέτρο της ποσότητας φωτός που απορροφάται από τη διαλυμένη ουσία σε ένα δεδομένο μήκος κύματος και από την απόσταση μέσω της οποίας περνάει το φως. Δείγμα ή απόσταση διαδρομής και συγκέντρωση διαλυτής ουσίας. Γενικά, ο στόχος της μέτρησης της απορρόφησης είναι η μέτρηση της συγκέντρωσης του δείγματος.
Συστατικά του φασματοφωτομέτρου
Κάθε φασματοφωτόμετρο αποτελείται από μια πηγή φωτός, έναν διαχωριστή (φακό ή μια συσκευή εστίασης για τη μετάδοση ισχυρών και ευθέων ακτίνων), ένα μονοχρωμικό για το διαχωρισμό δεσμών διαφορετικών μηκών κύματος και ένα επιλογέα μήκους για την επιλογή του κύματος ή της αύλακας του επιθυμητού μήκους κύματος. Το μήκος κύματος του φωτός που χρησιμοποιείται στο φασματοφωτόμετρο που παρουσιάζεται σε αυτό το βίντεο βρίσκεται στην περιοχή του υπεριώδους και ορατού φωτός. Το φασματοφωτόμετρο περιλαμβάνει επίσης ένα στήριγμα δείγματος, ένα φωτοανιχνευτή και μια οθόνη που εμφανίζει τα αποτελέσματα του ανιχνευτή.
Το πιο πρόσφατο φασματοφωτόμετρο συνδέεται απευθείας με έναν υπολογιστή, όπου μπορούν να ελεγχθούν πειραματικές παράμετροι και να εμφανιστούν τα αποτελέσματα.
Αρχή λειτουργίας του φασματοφωτομέτρου
Όταν πραγματοποιείτε φασματοφωτομετρία, είναι σημαντικό να λαμβάνετε κατάλληλες προφυλάξεις, όπως τη χρήση γαντιών, ανάλογα με τον τύπο του βιολογικού ή χημικού διαλύματος που χρησιμοποιείτε.
Ενεργοποιήστε τη συσκευή και αφήστε τη λάμπα και τα ηλεκτρονικά να θερμανθούν πριν μετρήσετε το φάσμα UV-Vis του δείγματος.
Προετοιμάστε ένα τυφλό δείγμα του ιδίου διαλύματος με το ίδιο pH και παρόμοια ιοντική ισχύ, αλλά χωρίς τα συστατικά που πρέπει να αναλυθούν. δεδομένου ότι η κυψελίδα και ο διαλύτης μπορούν να διασπείρουν το φως, είναι απαραίτητο να αναλυθεί το δείγμα.
Ο παραδοσιακός κάτοχος δείγματος φασματοφωτόμετρου έχει σχεδιαστεί για να κρατά πλαστικά και χαλαζία κύπελλα. Τοποθετήστε το αρχικό διάλυμα σε ένα μπολ.
Μετά το σκούπισμα των δακτυλικών αποτυπωμάτων και την εκτόξευσή τους στο εξωτερικό μέρος του μπολ, τοποθετήστε σωστά την κυψελίδα στη θήκη δείγματος και κλείστε την πόρτα του καπακιού.
Μην ξεχνάτε ποτέ να κλείσετε την πόρτα επειδή η υπεριώδης ακτινοβολία από ένα ανοικτό φασματοφωτόμετρο μπορεί να βλάψει τα μάτια και το δέρμα σας
Προγραμματίστε το επιθυμητό εύρος μήκους κύματος ή το μήκος κύματος που θα μεταδοθεί στο δείγμα. Αυτό εξαρτάται από το καλύτερο μήκος κύματος που μπορεί να απορροφήσει το συστατικό που αναλύεται. Στη συνέχεια η μηχανή μηδενίζεται μετρώντας το τυφλό δείγμα, το οποίο αφαιρεί την απορρόφηση του πυθμένα λόγω του ρυθμιστικού δείγματος.
Ανάλογα με τον τύπο πειράματος φασματοφωτομετρίας που κάνετε, μπορεί να είναι απαραίτητο να δημιουργηθεί μια πρότυπη καμπύλη πριν από τη μέτρηση του δείγματος, από την οποία μπορεί να προσδιοριστεί η συγκέντρωση της ένωσης που αναλύεται στο δείγμα.
Αφήστε το δείγμα να φτάσει στη σωστή θερμοκρασία και αναμίξτε απαλά για να αποφύγετε την εισαγωγή φυσαλίδων. Το δείγμα μπορεί να προστεθεί απευθείας στο κύπελλο μέσα στο μηχάνημα και μπορεί να γίνει ανάγνωση.
Αφού μετρηθεί το δείγμα για απορρόφηση, το πείραμα υπολογίζεται σωστά. για παράδειγμα, για να προσδιοριστεί το επίπεδο συγκέντρωσης ή δραστικότητας ενζύμου.
Εφαρμογή φασματοφωτομέτρου
Μία από τις κοινές χρήσεις του φασματοφωτομέτρου είναι η μέτρηση της κυτταρικής πυκνότητας. Η μέτρηση πυκνότητας κυττάρων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή της καμπύλης λογαριθμικής ανάπτυξης βακτηρίων, από την οποία μπορεί να προσδιοριστεί ο βέλτιστος χρόνος για την ενσωμάτωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης.
Το φασματοφωτόμετρο μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση του ρυθμού χημικής αντίδρασης. Σε αυτή την ενσωμάτωση, η απορρόφηση χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της ενζυματικής αντίδρασης, η οποία εξαφανίζεται με το χρόνο μέσω μίας ενδιάμεσης αντίδρασης 452 nm. Ο ρυθμός αυτής της ενζυματικής βαθμίδας μπορεί να υπολογιστεί με την αντιστοίχιση των δεδομένων με την κατάλληλη εξίσωση.
Η εισαγωγή μικροσφαιροφωτομέτρου εξαλείφει την ανάγκη της υποδοχής δείγματος. Αυτά τα φασματοφωτόμετρα χρησιμοποιούν επιφανειακή τάση για τη διατήρηση του δείγματος.
Το μικροσφαιροφωτόμετρο είναι η καλύτερη επιλογή για τη μέτρηση της μάζας και της συγκέντρωσης μικρών και ακριβών δειγμάτων, όπως βιομορίων, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών και των νουκλεϊνικών οξέων.
Η απορρόφηση των πρωτεϊνών στα 280nm εξαρτάται από την περιεκτικότητα σε αρωματικές πλευρικές αλυσίδες που βρίσκονται σε τρυπτοφάνη, τυροσίνη και φαινυλαλανίνη, καθώς και ο δισουλφιδικός δεσμός μεταξύ των δύο κυστεϊνών.
Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης μπορεί να προσδιοριστεί με την απορρόφησή της στα 280nm και τον συντελεστή απορρόφησης της, η οποία βασίζεται στη σύνθεση των αμινοξέων.
Το DNA και το RNA έχουν τη μέγιστη απορρόφηση στα 260 nm, από τα οποία μπορούν να προσδιοριστούν οι συγκεντρώσεις τους. Η καθαρότητα των νουκλεϊνικών οξέων μπορεί επίσης να εκτιμηθεί από την αναλογία των μετρήσεων απορρόφησης σε συγκεκριμένα μήκη κύματος.