Ποσοτικοποίηση φασματοφωτομετρικών χρωματομετρικών πρωτεϊνών
Οι πρωτεΐνες είναι συνήθως ένα μείγμα πρωτεϊνών. Οι χρωματομετρικές δοκιμασίες βασίζονται σε συστατικά πρωτεΐνης: Τα αμινοξέα (π.χ. τυροσίνη, σερίνη) αντιδρούν με μια πρόσθετη χρωμογόνο ομάδα ή βαφή για να παράγουν έγχρωμο υλικό. Η συγκέντρωση του έγχρωμου υλικού σχετίζεται άμεσα με τον αριθμό των αμινοξέων που αντιδρά η πρωτεΐνη, αντανακλώντας έτσι τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης.
Χρωματομετρική μέθοδος
Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι όπως BCA, Bradford και Lowry.
Η μέθοδος Lowry: Με βάση την αρχαιότερη αντίδραση Biuret και βελτιωμένη. Η πρωτεΐνη αντιδρά με Cu2 για να παράγει μια μπλε αντίδραση. Ωστόσο, η μέθοδος Lowry είναι πιο ευαίσθητη από τη Biuret. Το μειονέκτημα είναι η ανάγκη διαδοχικής προσθήκης αρκετών διαφορετικών αντιδραστηρίων. η αντίδραση απαιτεί πολύ χρόνο. είναι ευαίσθητο σε μη πρωτεϊνικές ουσίες. οι πρωτεΐνες που περιέχουν EDTA, Triton χ-100 και θειική αμμωνία δεν είναι κατάλληλες για αυτή τη μέθοδο.
Δοκιμασία βικινκοκινινικού οξέος: Πρόκειται για μια νεότερη, πιο ευαίσθητη δοκιμασία πρωτεϊνών. Η πρωτεΐνη που πρόκειται να αναλυθεί αντιδρά με Cu2 σε ένα αλκαλικό διάλυμα για να παράγει Cu, το οποίο σχηματίζει ένα χηλικό με BCA για να σχηματίσει μωβ ένωση με μέγιστη απορρόφηση στα 562 nm. Η γραμμική σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης αυτής της ένωσης και της πρωτεΐνης είναι ισχυρή και η ένωση που σχηματίζεται μετά την αντίδραση είναι πολύ σταθερή. Σχετικά με τη μέθοδο Lowry, η λειτουργία είναι απλή και η ευαισθησία είναι υψηλή. Ωστόσο, παρόμοια με τη μέθοδο Lowry, είναι επιρρεπή σε παρεμβολές με πρωτεΐνες και απορρυπαντικά.
Η μέθοδος Bradford: Η αρχή αυτής της μεθόδου είναι ότι η πρωτεΐνη αντιδρά με το Coomassie Brilliant Blue για να παράγει μια έγχρωμη ένωση που απορροφά στα 595 nm. Το μεγαλύτερο χαρακτηριστικό του είναι η ευαισθησία του, η οποία είναι 2 φορές μεγαλύτερη από αυτή του Lowry και του BCA. Είναι απλούστερη και ταχύτερη. Απαιτεί μόνο ένα είδος αντιδραστηρίου αντίδρασης. Η ένωση μπορεί να είναι σταθερή για 1 ώρα για να διευκολύνει το αποτέλεσμα. Παρεμπόδιση του Lowry, η BCA αντιδρά με αναγωγικούς παράγοντες (π.χ. DTT, μερκαπτοαιθανόλη) συμβατά. Ωστόσο, εξακολουθεί να είναι ευαίσθητο στα απορρυπαντικά. Το κύριο μειονέκτημα είναι ότι διαφορετικά πρότυπα μπορούν να οδηγήσουν σε μεγάλες διαφορές στα αποτελέσματα του ίδιου δείγματος και δεν έχουν συγκρίσιμα αποτελέσματα.
Μερικοί ερευνητές που εκτίθενται για πρώτη φορά σε χρωματομετρικές μετρήσεις μπορεί να συγχέονται με τα αποτελέσματα των διαφόρων χρωματομετρικών δοκιμών. Ποιες μέθοδοι πιστεύετε ότι είναι συγκεχυμένες; Λόγω του γεγονότος ότι οι ομάδες αντιδρούν με διαφορετικούς τρόπους και οι χρωμογόνες ομάδες δεν είναι οι ίδιες, χρησιμοποιούνται ταυτόχρονα αρκετές μέθοδοι για να καταστούν οι συγκεντρώσεις του δείγματος ασυμβίβαστες. Για παράδειγμα, οι Keller κ.ά. εξέτασε την πρωτεΐνη στο ανθρώπινο γάλα και διαπίστωσε ότι οι συγκεντρώσεις που μετρήθηκαν από το Lowry και το BCA ήταν σημαντικά υψηλότερες από αυτές του Bradford. Η διαφορά ήταν σημαντική. Ακόμη και αν προσδιοριστεί το ίδιο δείγμα, το τυποποιημένο δείγμα που επιλέγεται με την ίδια χρωματομετρική μέθοδο είναι ασυμβίβαστο και η συγκέντρωση μετά τη δοκιμή είναι επίσης ασυμβίβαστη. Για παράδειγμα, χρησιμοποιήστε το Lowry για να δοκιμάσετε την πρωτεΐνη στο ομογενοποιημένο κύτταρο, χρησιμοποιώντας BSA ως πρότυπο, με συγκέντρωση 1,34 mg / ml, και σφαιρίνη ως πρότυπο με συγκέντρωση 2,64 mg / ml. Ως εκ τούτου, πριν από την επιλογή μιας χρωματομετρικής μεθόδου, είναι προτιμότερο να αναφέρεται η χημική σύνθεση του δείγματος που πρόκειται να εξεταστεί και να βρεθεί μια πρότυπη χημικώς πρότυπη πρωτεΐνη. Επιπλέον, η χρωματομετρική μέθοδος για την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών προκαλεί συχνά προβλήματα επειδή η τιμή απορρόφησης του δείγματος είναι πολύ χαμηλή, με αποτέλεσμα μεγάλη διαφορά μεταξύ της μετρούμενης συγκέντρωσης δείγματος και της πραγματικής συγκέντρωσης. Το βασικό ζήτημα είναι ότι το χρώμα του σημαντικού μέρους του φασματοφωτόμετρου 1011, η κυψελίδα, έχει ορισμένο χρόνο ημίσειας ζωής, έτσι ώστε κάθε χρωματομετρική μέθοδος να αναφέρει τον χρόνο δοκιμής της αντίδρασης. Όλα τα δείγματα (συμπεριλαμβανομένων των τυποποιημένων δειγμάτων) πρέπει να δοκιμαστούν εντός αυτού του χρονικού διαστήματος. Εάν ο χρόνος είναι πολύ μεγάλος, η τιμή απορρόφησης που αποκτάται γίνεται μικρότερη και η τιμή της μετατρεπόμενης συγκέντρωσης μειώνεται. Επιπροσθέτως, η θερμοκρασία αντίδρασης, η τιμή ρΗ του διαλύματος κλπ. Είναι όλοι σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν το πείραμα. Επιπλέον, είναι πολύ σημαντικό να χρησιμοποιηθεί πλαστική χρωματομετρία. Αποφύγετε τη χρήση κυψελίδων από χαλαζία ή γυαλί επειδή το χρώμα μετά την αντίδραση θα προκαλέσει το χρώμα του χαλαζία ή του γυαλιού, με αποτέλεσμα την ανακριβή απορρόφηση του δείγματος.
Η εταιρεία ειδικεύεται στην πώληση φασματοφωτομέτρων , ευπρόσδεκτοι πελάτες που έχουν ανάγκη να συμβουλευτούν και να αγοράσουν, θα σας προσφέρουμε ειλικρινή εξυπηρέτηση και ποιοτικά προϊόντα, καθώς και χαμηλότερες τιμές.
Ηλεκτρονικό ταχυδρομείο: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com