Τα φασματοφωτόμετρα έχουν γίνει εργαλεία ρουτίνας στα σύγχρονα εργαστήρια μοριακής βιολογίας. Συχνά χρησιμοποιείται για το νουκλεϊνικό οξύ, την ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών και τον ποσοτικό προσδιορισμό των συγκεντρώσεων βακτηριακής ανάπτυξης.
Απλή αρχή του φασματοφωτόμετρου
Το φασματοφωτόμετρο χρησιμοποιεί μια πηγή φωτός που μπορεί να παράγει πολλαπλά μήκη κύματος και περνά μέσα από μια σειρά φασματοσκοπικών συσκευών για να παράγει μία πηγή φωτός συγκεκριμένου μήκους κύματος. Αφού η φωτεινή πηγή διέλθει από το προς έλεγχο δείγμα, απορροφάται μέρος της πηγής φωτός και υπολογίζεται η απορρόφηση του δείγματος, μετατρέποντας έτσι τη συγκέντρωση του δείγματος. . Η απορρόφηση του δείγματος είναι ανάλογη προς τη συγκέντρωση του δείγματος.
Ποσοτικοποίηση των νουκλεϊνικών οξέων
Η ποσοτικοποίηση των νουκλεϊνικών οξέων είναι η συχνότερα χρησιμοποιούμενη λειτουργία του φασματοφωτομέτρου. Τα ολιγονουκλεοτίδια, μονόκλωνο, δίκλωνο ϋΝΑ και RNA μπορούν να ποσοτικοποιηθούν σε ρυθμιστικό διάλυμα. Η κορυφή απορρόφησης της υψηλότερης κορυφής απορρόφησης του νουκλεϊκού οξέος είναι 260 nm. Η μοριακή σύνθεση κάθε νουκλεϊνικού οξέος είναι διαφορετική, έτσι οι συντελεστές μετατροπής είναι διαφορετικοί. Για να ποσοτικοποιήσετε διαφορετικούς τύπους νουκλεϊνικών οξέων, επιλέξτε τους αντίστοιχους συντελεστές εκ των προτέρων. Για παράδειγμα, η απορρόφηση του 1 OD αντιστοιχεί σε 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA και 30 μg / ml Olig. Η απορρόφηση μετά τη δοκιμή μετατρέπεται από τους παραπάνω συντελεστές για να ληφθεί η αντίστοιχη συγκέντρωση του δείγματος. Πριν από τη δοκιμή, επιλέξτε τη σωστή διαδικασία, εισάγετε τον όγκο του αποθέματος διαλύματος και του αραιωτικού μέσου και, στη συνέχεια, ελέγξτε το κενό και το διάλυμα δείγματος. Ωστόσο, το πείραμα δεν ήταν πάντα ομαλό. Οι ασταθείς αναγνώσεις μπορεί να είναι ο μεγαλύτερος πονοκέφαλος για τον πειραματιστή. Τα όργανα με μεγαλύτερη ευαισθησία δείχνουν μεγαλύτερη απορρόφηση.
Στην πραγματικότητα, η αρχή του σχεδιασμού και η αρχή λειτουργίας του φασματοφωτομέτρου επιτρέπουν την απορρόφηση να μεταβάλλεται μέσα σε ένα ορισμένο εύρος, δηλαδή το όργανο έχει κάποια ακρίβεια και ακρίβεια. Για παράδειγμα, η ακρίβεια του βιοφωτομέτρου Eppendorf είναι ≤1,0% (1Α). Τα αποτελέσματα τέτοιων πολλαπλών εξετάσεων κυμαίνονται μεταξύ περίπου 1,0% του μέσου όρου και είναι κανονικά. Επιπλέον, είναι επίσης απαραίτητο να εξεταστούν οι φυσικοχημικές ιδιότητες του ίδιου του νουκλεϊνικού οξέος και το ρΗ του ρυθμιστικού διαλύματος στο οποίο διαλύεται το νουκλεϊνικό οξύ, η συγκέντρωση των ιόντων κλπ .: Όταν η συγκέντρωση ιόντων είναι πολύ υψηλή κατά τη διάρκεια της δοκιμής, διαβάζοντας μετατοπίσεις, γι 'αυτό συνιστάται η χρήση συγκεκριμένης τιμής pH και χαμηλής συγκέντρωσης ιόντων. Τα ρυθμιστικά, όπως το ΤΕ, σταθεροποιούν σε μεγάλο βαθμό τις μετρήσεις. Η συγκέντρωση αραίωσης του δείγματος είναι επίσης ένας παράγοντας που δεν μπορεί να αγνοηθεί: λόγω της αναπόφευκτης παρουσίας ορισμένων δειγμάτων σωματιδίων, ιδιαίτερα δειγμάτων νουκλεϊκού οξέος, στο δείγμα. Η παρουσία αυτών των μικρών σωματιδίων παρεμβαίνει στα αποτελέσματα των δοκιμών. Προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η επίδραση των σωματιδίων στα αποτελέσματα της δοκιμής, η απορρόφηση του νουκλεϊκού οξέος απαιτείται να είναι τουλάχιστον μεγαλύτερη από 0,1 Α και η απορρόφηση είναι κατά προτίμηση μεταξύ 0,1 και 1,5 Α. Εντός αυτού του εύρους, η παρεμβολή του τα σωματίδια είναι σχετικά μικρά και το αποτέλεσμα είναι σταθερό.
Αυτό σημαίνει ότι η συγκέντρωση του δείγματος δεν πρέπει να είναι πολύ χαμηλή ή πολύ υψηλή (πέρα από το εύρος δοκιμής του φωτομέτρου). Τέλος, οι παράγοντες λειτουργίας, όπως η ανάμειξη, πρέπει να είναι επαρκείς, διαφορετικά η τιμή απορρόφησης είναι πολύ χαμηλή, ακόμη και αρνητικές τιμές. το μείγμα δεν μπορεί να υπάρξει φυσαλίδες, το κενό υγρό δεν έχει αιωρούμενη ύλη, διαφορετικά η ανάγνωση μετράει δραστικά. η ίδια κυψελίδα πρέπει να χρησιμοποιηθεί για τη δοκιμή του τυφλού δείγματος και του δείγματος Διαφορετικά, η διαφορά συγκέντρωσης είναι πολύ μεγάλη. ο συντελεστής μετατροπής και η μονάδα συγκέντρωσης του δείγματος επιλέγονται με συνέπεια · η κυψελίδα με φθορά παραθύρου δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί. ο όγκος του δείγματος πρέπει να φθάνει στον ελάχιστο όγκο που απαιτείται από την κυψελίδα.
Εκτός από τη συγκέντρωση νουκλεϊνικού οξέος, το φασματοφωτόμετρο δείχνει επίσης αρκετές πολύ σημαντικές αναλογίες που υποδεικνύουν την καθαρότητα του δείγματος, όπως η αναλογία του Α260 / Α280 που χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της καθαρότητας του δείγματος επειδή η κορυφή απορρόφησης της πρωτεΐνης είναι 280 nm. Ένα καθαρό δείγμα με αναλογία μεγαλύτερη από 1,8 (DNA) ή 2,0 (RNA). Εάν ο λόγος είναι μικρότερος από 1,8 ή 2,0, υποδηλώνει την παρουσία πρωτεϊνών ή φαινολικών ουσιών. Α 230 υποδεικνύει ότι υπάρχουν μερικές μολυσματικές ουσίες στο δείγμα, όπως υδατάνθρακες, πεπτίδια, φαινόλες κλπ. Και η αναλογία του καθαρότερου νουκλεϊκού οξέος Α 260 / Α 230 είναι μεγαλύτερη από 2.0. Το Α 320 ανιχνεύει τη θολερότητα του διαλύματος και άλλους παράγοντες παρεμβολής. Για καθαρά δείγματα, το Α 320 είναι γενικά 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co, Ltd
Προσθήκη: No.168 Wuchang Ave., Yuhang District, Hangzhou 310023, Κίνα
ΤΗΕ: + 86-571-88739859
Τηλέφωνο: +8618658504900
Ηλεκτρονικό ταχυδρομείο: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com